025 – Observació de cèl·lules vegetals

Les cèl·lules vegetals van ser les primeres cèl·lules que ningú va veure mai. El 1665 Robert Hooke va posar una llesca de suro sota un microscopi, va descobrir que estava dividida en petits compartiments i va manllevar la paraula cèl·lula des de les petites habitacions d'un monestir. El que feia que el suro fos llegible quan el teixit animal no ho era és exactament el que fa que el material vegetal sigui el millor exemplar d'ensenyament avui dia: una paret de cel·lulosa rígida al voltant de cada cèl·lula dibuixa un límit visible tant si la cèl·lula està tinyida com si no.

Elodea, l'herba aquàtica, és l'elecció estàndard. La seva fulla té només dues capes cel·lulars de gruix, de manera que es pot muntar una fulla sencera de manera plana sense fer-ne talls i la llum hi passa directament. Dins de cada cèl·lula hi ha desenes de cloroplasts, densos en clorofil·la i, per tant, prou verds per a ser vistos sense cap mena de tint, mentre que una sola vacúol central gran ocupa la majoria del volum i pressiona el citoplasma i els cloroplasts en una capa fina contra la paret. Gairebé cada tret distintiu d'una cèl·lula vegetal —paret, cloroplasts, vacúol, una geometria tissular ordenada— és visible en una sola preparació.

El nucli n'és l'excepció. És present en totes les cèl·lules, però gairebé transparent i fàcil de perdre entre els cloroplasts, raó per la qual el laboratori utilitza dos portaobjectes en lloc d'un. El primer és una preparació senzilla amb aigua, que mostra les cèl·lules tal com són. El segon rep una gota de solució de Lugol —iode en iodur potassic—, que s'uneix a les proteccions i als àcids nucleics i tenyeix el nucli d'un color groc marronós clar. Engegareu la il·luminació transmesa, pujareu a 40×, 100× i 400× fent servir el cargol macromètric només a la potència més baixa, salvareu una imatge a cada pas i compareu directament els dos portaobjectes. Llegit conjuntament amb el laboratori 024 sobre cèl·lules animals, el parell fa que la diferència estructural entre els dos regnes sigui visible en lloc d'estar només esmentada.

Objectius educatius

Familiarització amb l'entorn del laboratori

• Localitzeu el microscopi i el seu interruptor, els tres objectius útils, els cargols macroètric i micròmetric, la platina, el vas de precipitats, les pinces, els portaobjectes, els cobreobjectes i el paper absorbent abans de començar.

Funcionament d'un microscopi òptic compost

• Configureu la il·luminació transmesa (de camp clar) des de baix i expliqueu per què una fulla de dos cèl·lules de gruix és un espècimen gairebé ideal per a aquesta tècnica.
• Canvia els objectius en ordre ascendent — 4×, després 10× i després 40× — i calcula la magnificació total que proporciona cadascun amb un ocular de 10×.
• Utilitzeu el cargol macromètric només amb el menor augment i el micromètric amb els augments superiors, i expliqueu per què l'objectiu d'immersió en oli de 100× s'exclou d'aquest laboratori.

Preparació d'una preparació humida

• Transferiu una fulla petita amb unes pinces sense esquinçar-la ni plegar-la, inundeu-la amb líquid, baixeu un cobreobjectes sense atrapar aire i eixugueu l'excés perquè el cobreobjectes quedi pla.
• Expliqueu per què la fulla s'ha de mantenir humida tot el temps i què passa a les cèl·lules si es permet que la preparació s'assequi.

Identificació d'estructures cel·lulars vegetals

• Identifiqueu la paret cel·lular, els cloroplasts, la vacuola central i —en la preparació tenyida— el nucli, i indiqueu la funció de cadascun.
• Descriviu la disposició de les cèl·lules al teixit i relateu aquesta geometria de totxo amb la presència d'una paret rígida.

Ús d'un tint biològic

• Compareu directament el muntatge en aigua i el muntatge amb Lugol, i digueu amb precisió quina estructura revela el tint i quines estructures ja eren visibles sense aquest.

Observació i registre

• Deseu una imatge de microscopi a cada augment per a totes dues andanes, annotateu la vista tenyida a 400× i estimeu les dimensions cel·lulars a partir del camp de visió conegut en lloc d'endevinar.

Protocol

Preparació

1. Enceneu el microscopi prement l'interruptor situat a la part frontal de l'aparell. S'activarà el il·luminador, de manera que la llum transmesa travessarà la mostra des de baix, cosa que és ideal per a exemplars transparents.
2. Ompliu el got petit completament amb aigua freda de l'aixeta.
3. Poseu dos portaobjectes nets a la vostra zona de treball.

Preparació de la primera diapositiva

1. Amb unes pinces, poseu suaument una petita fulla d'Elodea al primer portaobjectes.
2. Poseu una gota d'aigua al primer portaobjectes.
3. Cobriu el portaobjectes amb un cobrallentilles.
4. Eixuga l'excés d'aigua amb paper absorbent.

Preparació de la segona diapositiva

1. Amb unes pinces, col·loca suaument una petita fulla d'Elodea al segon portaobjectes.
2. Poseu una gota de Lugol al segon portaobjectes.
3. Cobriu el portaobjectes amb un cobrallàmines.
4. Eixuga l'excés d'aigua amb paper absorbent.

Observació de la primera diapositiva

1. Col·loca el portaobjectes a la platina del microscopi.
2. Feu clic al botó «Microscopi» a la tauleta per veure la imatge del microscopi.
3. Podeu desar una imatge de la vista del microscopi observada fent clic al botó «Desa la imatge«, situat a la zona inferior esquerra de la secció «Microscopi«.

Ajustament del microscopi

1. Ajusteu la magnificació tocant els objectius del microscopi. Comenceu l'observació amb una magnificació de 40x (objectiu vermell – marcat com Plan 4/0.10).
2. Preciseu l'enfocament amb els botons d'ajust gruixut situats a l'esquerra i a la dreta del microscopi. Utilitzeu els botons gruixuts només a aquest augment.
3. Incrementeu gradualment el augment de 40x a 100x (objectiu groc – etiquetat com a Plan 10/0.25), després a 400x (objectiu blau – etiquetat com a Plan 40/0.65), reenfocant cada vegada només amb el cargol micromètric. A aquests augments, el cargol macromètric pot fer xocar l'objectiu contra el portaobjectes.

Nota: Una ampliació de 1000x (objectiu de blanc – etiquetat Plan 100/1.25) requereix l'ús d'oli entre l'objectiu i la làmina de vidre. Per tant, no utilitzem aquest objectiu en aquest laboratori.

Observació de la segona diapositiva

1. Reemplaça la primera diapositiva per la segona que conté la fulla d'Elodea i el Lugol.
2. Observeu amb un augment de 400x (objectiu blau – etiquetat Plan 40/0.65) per identificar un nucli cel·lular, que hauria d'aparèixer de color groc per la Lugol.
3. Enregistrament d'observacions: Documenteu o registreu les observacions importants.

Apagar el microscopi

1. Apagueu el microscopi prement l'interruptor a la part frontal del dispositiu.

Resultats previstos

Un conjunt d'imatges de referència de les vistes del microscopi esperades està disponible a aquest document (PDF).

Com són les cèl·lules i per què

L'únic fet que explica gairebé totes les observacions és la paret cel·lular. Una capa de cel·lulosa d'entre 0,1 i 1 µm d'espessor envolta cada cèl·lula, és prou rígida per resistir la deformació i està cimentada als seus veïns. Per tant, les cèl·lules no poden arrodonir-se, lliscar les unes sobre les altres ni superposar-se: mantenen una forma rectangular fixa i cobren la fulla en fileres ordenades. Elodea Les cèl·lules de les fulles fan aproximadament 50–100 µm de llarg i 20–30 µm d'ample, de manera que a 400× només un grapat omplen el camp; són prou grans perquè la disposició, i no només la cèl·lula individual, esdevingui l'objecte d'estudi.

La paret també explica la vacuòla. Com que la paret pot resistir la pressió, la cèl·lula pot absorbir aigua per osmosi fins que el seu contingut pressiona cap a l'exterior contra la paret a una pressió de turgor de diversos centenars de kilopascals. L'aigua es manté en una gran vacuola central, que en una cèl·lula madura ocupa entre el 80 i el 90 % del volum i comprimeix el citoplasma, els cloroplasts i el nucli en una fina capa perifèrica. És per això que els cloroplasts apareixen com un rebord en lloc d'un disc ple, i per què el centre de cada cèl·lula sembla buit. Una cèl·lula animal col·locada en la mateixa aigua s'inflaria i esclataria, ja que no té paret que faci de contrapunt — enllaç directe al laboratori 004 sobre l'osmosi.

Els cloroplasts són visibles sense cap tinció perquè ja en contenen una. La clorofil·la absorbeix fortament en el vermell i el blau i transmet en el verd, de manera que cada cloroplast —un orgànul amb forma de lent de prop de 5 µm de diàmetre— treu prou llum del feix per registrar-se com un cos verd distintiu. Un de típic Elodea la cèl·lula en conté unes quantes dotzenes. També són mòbils, i deriven lentament amb el citoplasma, que és un dels pocs processos vius observables amb un microscopi òptic.

Augment, resolució i camp de visió

La magnificació total és el producte de l'objectiu i l'ocular: amb l'ocular estàndard de 10×, M = M_objecte × M_ull dona 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× i 40 × 10 = 400×. El que realment es pot separar està determinat, en canvi, per l'obertura numèrica impresa després de la potència de cada objectiu. Segons el criteri d'Abbe d = λ / (2 × NA); per a la llum verda a λ = 550 nm l'objectiu vermell dona d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, el groc 1,1 µm, i el blau 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Per tant, un cloroplast de 5 µm és resoluble per tots tres, la qual cosa coincideix amb l'observació que els granets verds són visibles des de 100×; l'objectiu d'oli exclòs de 100× (NA 1,25) arribaria a 0,22 µm, però només amb oli d'immersió per conduir els raigs d'angle elevat a través de l'espai.

El camp de visió s'estreta en proporció a la potència de l'objectiu. Per a un ocular de camp de 18 mm, el diàmetre visible és de 18 ÷ 4 = 4,5 mm a l'objectiu vermell, 1,8 mm al groc i 18 ÷ 40 = 0,45 mm, o 450 µm, al blau. Això proporciona una manera de mesurar les cèl·lules sense un gratícol: un camp de 400× de 450 µm d'amplada, recorregut per unes sis cèl·lules d'una punta a l'altra, situa cada cèl·lula en uns 75 µm de llarg, dins del rang esperat. La profunditat de camp disminueix encara més ràpidament, des de desenes de micròmetres a 40× fins a menys d'un micròmetre a 400×, motiu pel qual el botó de moviment gruixut està restringit a potències òptiques baixes — a 400× l'objectiu queda a una fracció de mil·límetre sobre el portaobjectes i un moviment gruixut fa que el vidre topi amb el vidre.

Resum de tasques per rang de qualificació

De 9è a 10è grau

• Enfocament — operar el microscopi de manera segura i identificar les parts d'una cèl·lula vegetal, amb el vocabulari corresponent: objectiu, ocular, platet, enfocament gruixut i fi, preparat humit, portaobjectes, colorant, paret cel·lular, cloroplast, vacuola, nucli.
• Activitats — prepara les dues laminetes, observa cadascuna a 40×, 100× i 400×, i desa les sis imatges. Dibuixa la vista tenyida a 400× i etiqueta la paret cel·lular, un cloroplast, la vacuola central i el nucli. Respon les preguntes guiades: de quin color són els cloroplasts i per què es poden veure sense cap tinció? Quina estructura única va revelar la solució de Lugol? Per què les cèl·lules estan disposades en fileres ordenades en lloc d'estar apilades de manera aleatòria?

11è curs

• Enfocament — quantificant l'observació i enllaçant cada estructura amb la seva funció.
• Activitats — calcular la magnificació total de cada objectiu amb un ocular de 10×; utilitzar el camp visual (18 mm ÷ poder de l'objectiu) per estimar la longitud i l'amplada d'una cèl·lula i el diàmetre d'un cloroplast, i comparar-los amb els valors acceptats de 50–100 µm, 20–30 µm i 5 µm; explicar com la paret cel·lular justifica tant la forma rectangular com l'arranjament en rajoles; explicar per què els cloroplasts formen un rebord al voltant d'un centre aparentment buit, nomenant l'estructura responsable; i elaborar una taula comparativa costat a costat amb les cèl·lules bucals del laboratori 024, on s'enumeren totes les estructures presents en una i absents en l'altra.

12è curs / Nivell universitari

• Enfocament — l'òptica que limitava l'instrument, la fisicoquímica de la turgència i la selectivitat del tint.
• Activitats — calculeu el límit d'Abbe d = λ / (2 × NA) per als quatre objectius, incloent-hi el 100×/1.25 exclòs, i expliqueu què fa l'oli d'immersió a l'obertura numèrica i per què l'objectiu no es pot utilitzar sense aquest; distingiu la resolució del contrast i feu servir aquesta distinció per explicar per què els cloroplasts no necessiten colorant mentre que el nucli sí; relacioneu el vacuol central amb el potencial hídric i la pressió de turgència, predicteu què s'observaria després de muntar la fulla en una solució salina concentrada en lloc d'aigua i anomeneu el resultat; expliqueu la química de la solució de Lugol (formació de triiodur, afinitat per les proteïnes i els àcids nucleics, i la reacció blau-negre independent amb el midó) i predicteu com diferiria la vista tenyida entre una fulla mantinguda a la llum brillant i una altra mantinguda en la foscor durant 48 hores; i dissenyeu un control que distingeixi una paret cel·lular autèntica de la vora d'una bombolla d'aire atrapada.

Equipament de laboratori

Instruments

• Microscopi òptic compost amb il·luminador transmès i objectius Plan 4/0,10, Plan 10/0,25 i Plan 40/0,65 amb un ocular de 10× — 40×, 100× i 400× en total (l'objectiu d'immersió en oli Plan 100/1,25 no s'utilitza)
• 2 portaobjectes de microscopi
• 2 cobreobjectes
• Pinces (per manipular les fulles i els cobreobjectes)
• Gotes
• Vas de precipitats (50 mL), ple d'aigua
• Paper absorbent

Productes

• Planta aquàticaElodea) fulles en suspensió — una fulla petita per portaobjectes
• Aigua (1 gota, primera diapositiva)
• Solució de Lugol 2% (1 gota, segona lamineta)