025 – Observarea celulelor vegetale

Celulele vegetale au fost primele celule pe care le-a văzut cineva vreodată. În 1665, Robert Hooke a pus o așchie de plută sub un microscop, a constatat că era împărțită în mici compartimente și a împrumutat cuvântul celulă din micile chilii ale unei mănăstiri. Ceea ce a făcut pluta lizibilă acolo unde țesutul animal nu a fost este exact ceea ce face ca materialul vegetal să fie un specimen didactic mai bun astăzi: un perete rigid de celuloză în jurul fiecărei celule trasează o limită vizibilă, indiferent dacă celula este colorată sau nu.

Elodea, buruiana acvatică, este alegerea standard. Frunza sa are o grosime de doar două straturi de celule, astfel încât o frunză întreagă poate fi montată plat, fără a fi secționată, iar lumina trece direct prin ea. În interiorul fiecărei celule se află zeci de cloroplaste, pline de clorofilă și, prin urmare, suficient de verzi încât să poată fi văzute fără nicio colorare, în timp ce o singură vacuolă centrală mare ocupă cea mai mare parte a volumului și presează citoplasma și cloroplastele într-un strat subțire împotriva peretelui. Aproape fiecare caracteristică distinctivă a unei celule vegetale — perete, cloroplaste, vacuolă, o geometrie ordonată a țesutului — este vizibilă într-o singură preparare.

Nucleul constituie excepția. Este prezent în fiecare celulă, dar este aproape transparent și ușor de pierdut printre cloroplaste, motiv pentru care laboratorul folosește două lame în loc de una. Prima este o preparare simplă în apă, care arată celulele așa cum sunt. A doua primește o picătură de soluție Lugol – iod în iodură de potasiu – care se leagă de proteine și acizi nucleici și colorează nucleul într-un galben-maroniu distinct. Veți porni iluminatorul prin transmisie, veți avansa prin măririle de 40×, 100× și 400× utilizând șurubul macrometric doar la puterea cea mai mică, veți salva o imagine la fiecare pas și veți compara direct cele două lame. Citite alături de laboratorul 024 privind celulele animale, cele două preparate fac ca diferența structurală dintre cele două regnuri să fie vizibilă, și nu doar menționată.

Obiective educaționale

Familiarizarea cu mediul de laborator

• Localizați microscopul și comutatorul acestuia, cele trei obiective utilizabile, butonul de focalizare macro și cel de focalizare micro, măsuța portaobiect, paharul de laborator, penseta, lamele, sticlele acoperitoare (lamelele) și hârtia absorbantă înainte de a începe.

Funcționarea unui microscop optic compus

• Configurați iluminarea prin transmisie (în câmp luminos) de deducere și explicați de ce o frunză groasă de două celule este un specimen aproape ideal pentru aceasta.
• Schimbați obiectivele în ordine crescătoare — 4×, apoi 10×, apoi 40× — și calculați mărirea totală pe care o oferă fiecare cu un ocular de 10×.
• Folosește focalizarea coarser doar la cea mai mică mărire și focalizarea fină la cele mai mari, și explică de ce obiectivul cu imersie în ulei de 100× este exclus din acest laborator.

Pregătirea unei preparate native

• Transferați o frunză mică cu o pensetă fără a o rupe sau îndoi, inundați-o cu lichid, coborâți o lamelă acoperitoare fără a prinde aer și absorbiți excesul astfel încât lamela să stea plată.
• Frunza trebuie să rămână umedă pe tot parcursul procesului pentru a menține forma și structura celulelor vii, permițând observarea clară la microscop. Dacă preparatul are voie să se usuce, celulele se vor deshidrata, se vor strânge și se vor deforma (plasmoliză), iar structurile intracelulare își vor pierde aspectul natural, făcând imposibilă observarea corectă a acestora.

Identificarea structurilor celulare vegetale

• Identificați peretele celular, cloroplastele, vacuola centrală și – pe lama colorată – nucleul, și menționați funcția fiecăruia.
• Descrieți aranjamentul celulelor din țesut și corelați acea geometrie asemănătoare unor cărămizi cu prezența unui perete rigid.

Utilizarea unui colorant biologic

• Comparați direct colorantul pe bază de apă cu cel Lugol și precizați exact ce structură evidențiază colorantul și ce structuri erau deja vizibile fără acesta.

Observare și înregistrare

• Salvați o imagine la microscop la fiecare mărire pentru ambele lamele, adnotați vederea colorată la mărirea 400× și estimați dimensiunile celulelor pornind de la câmpul vizual cunoscut, în loc să ghiciți.

Protocol

Pregătire

1. Porniți microscopul apăsând butonul de pe partea frontală a aparatului. Veți porni iluminatorul, astfel încât lumina transmisă să treacă prin eșantion de dedesubt, ceea ce este ideal pentru probe transparente.
2. Umpleți paharul mic complet cu apă rece de la robinet.
3. Așezați două lame curate pe suprafața de lucru.

Pregătirea primului slide

1. Folosind o pensetă, așezați cu grijă o frunză mică de Elodea pe prima lamă.
2. Pune o picătură de apă pe prima lamă.
3. Acoperiți lamela cu o lameliță de protecție.
4. Ștergeți ușor excesul de apă cu un șervețel absorbant.

Pregătirea celui de-al doilea diapozitiv

1. Cu o pensetă, așezați cu grijă o mică frunz.
2. Pune o picătură de Lugol pe al doilea strat.
3. Acoperiți lamela cu un capac.
4. Ștergeți ușor excesul de apă cu un șervețel absorbant.

Observarea primului diapozitiv

1. Așezați lama pe platina microscopului.
2. Apăsați butonul «Microscop» de pe tabletă pentru a vizualiza imaginea microscopului.
3. Puteți salva o imagine a vederii microscopice observate făcând clic pe butonul « Salvare imagine « aflat în zona din stânga jos a secțiunii « Microscop «.

Ajustarea microscopului

1. Reglați mărirea atingând obiectivele microscopului. Începeți observația la o mărire de 40x (obiectiv roșu – marcat Plan 4/0.10).
2. Reglați focalizarea cu ajutorul butoanelor de reglare grosieră situate în partea stângă și dreaptă a microscopului. Utilizați butoanele de reglare grosieră numai la această mărire.
3. Măriți treptat mărirea de la 40x la 100x (obiectiv galben – marcat Plan 10/0,25), apoi la 400x (obiectiv albastru – marcat Plan 40/0,65), refocalizând de fiecare dată numai cu ajutorul butonului de reglare fină. La aceste măriri, butonul de reglare grosieră poate împinge obiectivul în lamelă.

Notă: O mărire de 1000x (obiectiv alb – etichetat Plan 100/1.25) necesită utilizarea uleiului între obiectiv și lamela de protecție. Prin urmare, nu folosim acest obiectiv în acest laborator.

Observația celui de-al doilea diapozitiv

1. Înlocuiți prima diapozitivă cu a doua diapozitivă, conținând frunza de Elodea și soluția Lugol.
2. Observați la mărire 400x (obiectiv albastru – etichetat Plan 40/0.65) pentru a identifica nucleul unei celule, care ar trebui să apară colorat în galben de către Lugol.
3. Înregistrarea observațiilor: Documentați sau înregistrați observațiile importante.

Oprirea microscopului

1. Opriți microscopul apăsând comutatorul din fața aparatului.

Rezultate anticipate

Un set de imagini de referință cu aspectele așteptate la microscop este disponibil în acest document (PDF).

Cum arată celulele și de ce

Singurul element care explică aproape toate observațiile este peretele celular. Un strat de celuloză cu grosimea de 0,1–1 µm înconjoară fiecare celulă, este suficient de rigid pentru a rezista la deformare și este lipit de celulele vecine. Prin urmare, celulele nu se pot rotunji, nu pot aluneca unele peste altele și nu se pot suprapune: ele păstrează o formă dreptunghiulară fixă și acoperă frunza în rânduri ordonate. Elodea celulele frunzelor au o lungime de aproximativ 50–100 µm și o lățime de 20–30 µm, astfel încât, la o mărire de 400×, doar câteva dintre ele umplu câmpul vizual — fiind suficient de mari încât dispunerea lor, și nu doar celula individuală, să devină obiectul studiului.

Peretele celular explică, de asemenea, existența vacuolei. Deoarece peretele poate rezista la presiune, celula poate absorbi apă prin osmoză până când conținutul său exercită o presiune turgorică de câteva sute de kilopascali asupra peretelui. Apa este reținută într-o singură vacuolă centrală mare, care, într-o celulă matură, ocupă 80–90 % din volum și comprimă citoplasma, cloroplastele și nucleul într-un strat periferic subțire. De aceea cloroplastele apar ca o margine, mai degrabă decât ca un disc plin, și de aceea centrul fiecărei celule pare gol. O celulă animală plasată în aceeași apă s-ar umfla și ar exploda, neavând un perete care să respingă presiunea — legătura directă cu laboratorul 004 privind osmoza.

Cloroplastele sunt vizibile fără nicio colorație, deoarece conțin deja una. Clorofila absoarbe puternic în roșu și albastru și transmite în verde, astfel încât fiecare cloroplast — un organit în formă de lentilă de aproximativ 5 µm lățime — îndepărtează suficientă lumină din fascicul pentru a se înregistra ca un corp verde distinct. Un tipic Elodea Celula conține câteva zeci. De asemenea, acestea sunt mobile, plutind încet odată cu citoplasma, ceea ce reprezintă unul dintre puținele procese vitale observabile la microscopul optic.

Mărire, rezoluție și câmp vizual

Mărirea totală este produsul dintre obiectiv și ocular: cu ocularul standard de 10×, M = M_obiect × M_ochi oferă 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× și 40 × 10 = 400×. Ceea ce poate fi separat în totalitate este stabilit în schimb de deschiderea numerică tipărită după puterea fiecărui obiectiv. Conform criteriului lui Abbe d = λ / (2 × NA); pentru lumina verde la λ = 550 nm obiectivul roșu oferă d = 550 nm ÷ (2 × 0.10) = 2.8 µm, cel galben 1.1 µm, iar cel albastru 550 nm ÷ (2 × 0.65) = 0.42 µm. Un cloroplast de 5 µm poate fi, prin urmare, diferențiat de toate cele trei, ceea ce se potrivește cu observația că granule verzi sunt vizibile de la 100×; obiectivul cu imersie în ulei de 100× exclus (NA 1.25) ar ajunge la 0.22 µm, dar numai cu ulei de imersie pentru a transporta razele cu unghi mare peste spațiu.

Câmpul vizual se îngustează proporțional cu puterea obiectivului. Pentru un ocular cu un număr de câmp de 18 mm, diametrul vizibil este de 18 ÷ 4 = 4,5 mm la obiectivul roșu, 1,8 mm la cel galben și 18 ÷ 40 = 0,45 mm, sau 450 µm, la cel albastru. Aceasta oferă o modalitate de a dimensiona celulelor fără o reticulă: un câmp de 400× cu o lățime de 450 µm acoperit de aproximativ șase celule cap la cap plasează fiecare celulă la o lungime de aproape 75 µm, în intervalul așteptat. Profunzimea de câmp scade și mai repede, de la zeci de micrometri la 40× la sub un micrometru la 400×, motiv pentru care butonul macrometric este restricționat la puterea mică – la 400× obiectivul se află la o fracțiune de milimetru deasupra lamelei acoperitoare, iar o mișcare macrometrică împinge sticla în sticlă.

Rezumatul temei pe intervale de note

Clasele a IX-a și a X-a

• Focus — utilizarea în siguranță a microscopului și identificarea părților unei celule vegetale, împreună cu vocabularul aferent: obiectiv, ocular, măsuță, șurub de focalizare macrometric și micrometric, preparat umed, lamelă acoperitoare, colorant, perete celular, cloroplast, vacuolă, nucleu.
• Activități — pregătește ambele lamele, observă-le pe fiecare la măriri de 40×, 100× și 400× și salvează cele șase imagini. Desenează imaginea colorată la mărirea de 400× și etichetează peretele celular, un cloroplast, vacuola centrală și nucleul. Răspundeți la întrebările ghidate: ce culoare au cloroplastele și de ce pot fi observate fără nicio colorare? Care structură a fost evidențiată de soluția Lugol? De ce celulele sunt dispuse în rânduri ordonate, în loc să fie îngrămădite la întâmplare?

Clasa a XI-a

• Focus — cuantificarea observației și corelarea fiecărei structuri cu funcția sa.
• Activități — calculați mărirea totală a fiecărui obiectiv cu un ocular de 10×; utilizați câmpul vizual (18 mm ÷ puterea obiectivului) pentru a estima lungimea și lățimea unei celule și diametrul unui cloroplast și comparați cu valorile acceptate de 50–100 µm, 20–30 µm și 5 µm; explicați cum peretele celular explică atât forma dreptunghiulară, cât și dispunerea în mozaic; explicați de ce cloroplastul formează o margine în jurul unui centru aparent gol, numind structura responsabilă; și construiți un tabel comparativ alăturat cu celulele bucale din laboratorul 024, enumerând fiecare structură prezentă în una și absentă în cealaltă.

Clasa a XII-a / Nivel universitar

• Focus — elementele optice care încadrează instrumentul, chimia fizică a turgorului și selectivitatea colorantului.
• Activități — calculați limita Abbe d = λ / (2 × NA) pentru toate cele patru obiective, inclusiv cel exclus de 100×/1.25, și explicați ce face uleiul de imersie cu deschiderea numerică și de ce obiectivul este inutilizabil fără el; distingeți rezoluția de contrast și folosiți această distincție pentru a explica de ce cloroplastele nu au nevoie de colorant, în timp ce nucleul da; puneți în corespondență vacuolă centrală cu potențialul hidric și presiunea de turgor, prognozând ce s-ar vedea după montarea frunzei într-o soluție salină concentrată în loc de apă și numind fenomenul; explicați chimia soluției Lugol (formarea triiodurii, afinitatea pentru proteine și acizi nucleici și reacția separată albastru-neagră cu amidonul) și prognozați cum ar diferi imaginea colorată între o frunză ținută în lumină puternică și una ținută la întuneric timp de 48 de ore; și concepeți un martor (control) care să distingă un perete celular autentic de marginea unei bule de aer prinse.

Esențiale de laborator

Instrumente

• Microscop optic compus cu iluminator pentru lumină transmisă și obiective Plan 4/0,10, Plan 10/0,25 și Plan 40/0,65 cu ocular 10× — mărire totală de 40×, 100× și 400× (obiectivul cu imersie în ulei Plan 100/1,25 nu este utilizat)
• 2 lame de microscop
• 2 lamele acoperitoare
• Pensetă (pentru manipularea frunzelor și a lamelelor acoperitoare)
• Picurători
• Pahar Berzelius (50 mL), umplut cu apă
• Hârtie absorbantă

Produse

• Ciuma apelor (Elodea) frunze în suspensie — câte o frunză mică pe lamă
• Apă (1 picătură, primul diapozitiv)
• Soluția lui Lugol 2% (1 picătură, a doua lamă)