La determinazione del gruppo sanguigno è uno dei test di routine più antichi e importanti della medicina. Karl Landsteiner identificò i gruppi ABO nel 1901 dopo aver notato che il sangue di alcune persone si agglutinava se mescolato con quello di altre, e il fattore Rh fu descritto quattro decenni dopo. Insieme, i due sistemi decidono se una trasfusione salva una vita o distrugge i globuli rossi del ricevente in pochi minuti, e vengono controllati prima di ogni trasfusione, in ogni gravidanza e nelle indagini medico-legali e di paternità.
Il test si basa su una singola idea molecolare. La superficie di un globulo rosso trasporta marcatori ereditari di zuccheri e proteine chiamati antigeni: l'antigene A, l'antigene B, entrambi o nessuno, e separatamente l'antigene Rh (D). Un siero contenente anticorpi contro uno di questi marcatori — un agglutinina — ha due o più siti di legame, quindi quando incontra cellule che portano il suo antigene bersaglio le unisce formando ammassi visibili. Questa è l'agglutinazione: la goccia perde il suo aspetto rosso liscio e uniforme e diventa granulosa, con macchie più scure in un liquido trasparente. Quando l'antigene è assente l'anticorpo non ha nulla a cui legarsi e la goccia rimane uniforme. Il test viene quindi letto come un semplice sì o no, per tre volte.
In questo laboratorio determinerai il gruppo sanguigno di otto campioni di sangue sconosciuti. Ciascun campione viene posto in tre pozzetti separati e trattato rispettivamente con siero anti-A, anti-B e anti-Rh, mescolando ogni pozzetto con una bacchetta di vetro che viene risciacquata e asciugata tra un pozzetto e l'altro in modo da non trasferire siero da un test a quello successivo. Dalla combinazione di tre risposte affermative o negative dedurrai il gruppo ABO e il fattore Rh di ciascun campione, per poi stabilire quali di essi potrebbero donare sangue in sicurezza ad altri.
Obiettivi Educativi
Familiarizzazione con l'ambiente di laboratorio
- Individuare le piastre per pozzetti e il relativo schema di etichettatura, i tre contagocce per siero, la bacchetta di vetro, l'acqua distillata e la carta assorbente, e comprendere il motivo per cui ciascun campione necessita di tre pozzetti anziché uno.
Manipolare i campioni biologici in sicurezza
- Tratta ogni campione di sangue come potenzialmente infetto: indossa guanti e protezione per gli occhi, evita il contatto con la pelle e smaltisci il materiale contaminato come rifiuto a rischio biologico anziché come normale immondizia.
Evitare la contaminazione incrociata
- Risciacquare e asciugare la bacchetta di vetro tra ogni operazione di miscelazione e spiegare quale sarebbe l'aspetto di un falso positivo se del siero venisse trasportato da un pozzetto anti-A a un pozzetto anti-B.
- Aggiungere il siero al sangue senza toccare il pozzetto con la punta del contagocce, in modo che il siero di stock non venga mai contaminato di ritorno.
Lettura di una reazione di agglutinazione
- Distinguere una goccia autenticamente agglutinata — granulosa, agglomerata, con aggregati visibili su uno sfondo più chiaro — da una goccia non reagita che rimane liscia e uniformemente colorata.
- Registra ciascuna delle ventiquattro osservazioni come un valore positivo o negativo prima di tentare qualsiasi interpretazione.
Determinazione del gruppo ABO e del fattore Rh
- Convertire un pattern di tre risultati in un gruppo sanguigno e indicare quali antigeni sono presenti sulle cellule e quali anticorpi sono quindi presenti nel plasma.
Ragionamento sulla compatibilità trasfusionale
- Utilizza i risultati della tipizzazione per prevedere quali coppie donatore-ricevente sono sicure e spiega in termini di antigene-anticorpo perché il gruppo O Rh− è il donatore universale di globuli rossi e il gruppo AB Rh+ è il ricevente universale.
Protocollo
- Posizionare 5 gocce di campione di sangue 1 in ciascuno dei 3 pozzetti identificati come segue:
- bene 1 (anti_A)
- bene 1 (anti_B)
- bene 1 (anti_Rh)
- Mettere 2 gocce di agglutinina anti-A nel pozzetto identificato con 1 (1/anti-A).
- Mescolare immediatamente con una bacchetta di vetro pulita.
- Mettere 2 gocce di agglutinina anti-B nel pozzetto identificato 1 (1/anti-B).
- Mescolare immediatamente con una bacchetta di vetro pulita.
- Aggiungi 2 gocce di agglutinina anti-Rh nel pozzo identificato 1 (1/anti-Rh).
- Mescolare immediatamente con una bacchetta di vetro pulita.
- Sciacquare l'asta di vetro con acqua distillata.
- Asciuga l'asta di vetro con carta assorbente.
- Ripetere i passaggi per i campioni di sangue 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8.
Risultati Previsti
| Campione di sangue | anti-A | anti-B | anti-Rh | Gruppo sanguigno |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Agglutinazione | — | Agglutinazione | A Rh+ (A+) |
| 2 | Agglutinazione | Agglutinazione | — | AB Rh− (AB−) |
| 3 | — | — | — | 0 Rh− (0−) |
| 4 | Agglutinazione | — | — | A Rh negativo (A−) |
| 5 | — | — | Agglutinazione | 0 Rh+ (0+) |
| 6 | Agglutinazione | Agglutinazione | Agglutinazione | AB Rh+ (AB+) |
| 7 | — | Agglutinazione | — | 0 Rh− (0−) |
| 8 | — | Agglutinazione | Agglutinazione | 0 Rh+ (0+) |
Come si legge il modello
Ogni pozzetto risponde a una domanda: questo antigene è presente sulle cellule? L'agglutinazione con anti-A significa che l'antigene A è presente, l'agglutinazione con anti-B significa che l'antigene B è presente e il gruppo ABO ne consegue direttamente: solo A dà il gruppo A, solo B dà il gruppo B, entrambi danno il gruppo AB, nessuno dei due dà il gruppo O. Il terzo pozzetto viene letto indipendentemente dai primi due: l'agglutinazione con anti-Rh significa che le cellule portano l'antigene D e il campione è Rh positivo, la mancata agglutinazione significa Rh negativo. Il campione 3 è l'unico a dare tre negatività ed è l'unico O Rh−; il campione 6 è l'unico a dare tre positività ed è l'unico AB Rh+.
Perché si formano i grumi
Le agglutinine anti-A e anti-B sono anticorpi IgM, grandi molecole pentameriche con dieci siti di legame per l'antigene. Una singola molecola di IgM può quindi legare più globuli rossi contemporaneamente, e poche migliaia di essi trasformano una sospensione liscia in un reticolo di cellule collegate nel giro di secondi. Questo è il motivo per cui la reazione ABO viene letta a temperatura ambiente a occhio nudo e non richiede incubazione. L'anti-D è tipicamente un'IgG, con soli due siti di legame, per cui in un laboratorio clinico il test per il fattore Rh richiede spesso una reazione più lunga o un reagente aggiunto; qui viene letto allo stesso modo degli altri.
Gli anticorpi ABO sono anche insoliti in quanto presenti senza una precedente esposizione al sangue umano. Un individuo di gruppo A porta anti-B nel plasma fin dall'infanzia, quasi certamente stimolati da strutture zuccherine molto simili presenti sui batteri intestinali. Ogni individuo possiede quindi anticorpi esattamente contro quegli antigeni ABO di cui le proprie cellule sono sprovviste, la regola che rende l'incompatibilità ABO così immediatamente pericolosa.
Conseguenze della trasfusione
| Gruppo | Antigeni sui globuli rossi | Anticorpi nel plasma | Può ricevere globuli rossi da |
|---|---|---|---|
| A | A | anti-B | A, O |
| B | B | anti-A | B, O |
| AB | A e B | nessuno | A, B, AB, 0 |
| O | nessuno | anti-A e anti-B | O |
Rh aggiunge un secondo vincolo asimmetrico. Un ricevente Rh− che riceve cellule Rh+ non reagisce alla prima esposizione, poiché l'anti-D non è naturalmente presente, ma il sistema immunitario viene sensibilizzato e una successiva trasfusione di Rh+ può provocare una grave emolisi. Lo stesso meccanismo è alla base della malattia emolitica del neonato: una madre Rh− che porta in grembo un feto Rh+ può produrre anticorpi anti-D che attraversano la placenta in una gravidanza successiva, motivo per cui viene somministrata un'immunoglobulina profilattica anti-D. Dei otto campioni qui presenti, il 2, il 3, il 4 e il 7 sono Rh negativi e avrebbero bisogno di sangue Rh−.
Riepilogo del compito per intervallo di voti
Classe 9-10
- Concentrati — attenta osservazione e il vocabolario del test: antigene, anticorpo, agglutinina, agglutinazione, gruppo ABO, fattore Rh, donatore, ricevente.
- Attività — digita tutti gli otto campioni, registra ciascuno dei ventiquattro pozzetti come positivo o negativo in una griglia dei risultati, quindi assegna il nome al gruppo di ciascun campione in base al suo pattern. Rispondi alle domande guidate: quale campione non ha dato alcuna reazione e cosa ti dice questo sui suoi globuli rossi? Perché la bacchetta di vetro deve essere sciacquata tra un pozzetto e l'altro?
Undicesimo anno
- Concentrati — passando dall'osservazione all'immunologia sottostante e utilizzando i risultati per fare previsioni.
- Attività — per ciascuno degli otto campioni, indicare gli antigeni presenti sulle cellule e gli anticorpi ABO nel plasma; costruire la griglia completa di compatibilità donatore-ricevente per gli otto campioni e identificare ogni singolo accoppiamento sicuro; spiegare perché il campione 3 può donare globuli rossi a tutti gli altri sette mentre il campione 6 non può donare a nessuno di essi; e spiegare perché il test Rh deve essere letto separatamente dai test ABO anziché essere combinato con essi.
12ª classe / Livello universitario
- Concentrati — la genetica e la chimica degli anticorpi.
- Attività — determinare i possibili genotipi ABO alla base di ciascun fenotipo osservatoAiA oAi per il gruppo A e così via) e spiegare perché AB è codominante mentre O è recessivo; rendere conto della differenza tra IgM e IgG in termini di valenza e perché ciò modifica il modo in cui il risultato anti-D viene ottenuto clinicamente; ideare un controllo di tipizzazione inversa che confermi ciascuno degli otto risultati e affermare cosa implicherebbe una discrepanza tra la tipizzazione diretta e inversa; e spiegare il meccanismo e la tempistica della profilassi anti-D in una madre Rh−, utilizzando i campioni 2, 3, 4 e 7 come casi pratici.
Materiale essenziale di laboratorio
Strumenti
- Piastre per pozzetti (tre pozzetti per campione di sangue, etichettati anti-A, anti-B e anti-Rh)
- Contagocce, uno per siero
- Bacchetta di vetro (per agitazione)
- Carta assorbente
- Guanti e protezione per gli occhi
Prodotti
- 8 campioni di sangue di gruppo ignoto (5 gocce di ciascuno per pozzetto)
- Siero agglutinante anti-A (2 gocce per test)
- Siero anti-agglutinina B (2 gocce per test)
- Siero anti-Rh agglutinante (2 gocce per test)
- Acqua distillata (per sciacquare la bacchetta di vetro)