Určování krevní skupiny je jedním z nejstarších a nejzávažnějších rutinních vyšetření v medicíně. Karl Landsteiner identifikoval skupiny ABO v roce 1901 poté, co si všiml, že krev některých lidí se po smíchání s krev jiných srazila, a Rh faktor byl popsán o čtyři desetiletí později. Tyto dva systémy dohromady rozhodují o tom, zda transfúze zachrání život, nebo během několika minut zničí červené krvinky příjemce, a kontrolují se před každou transfúzí, v každém těhotenství a při forenzních a otcovských vyšetřeních.
Test stojí na jediné molekulární myšlence. Povrch červené krvinky nese zděděné cukrové a proteinové značky zvané antigeny: antigen A, antigen B, oba, nebo ani jeden, a odděleně antigen Rh (D). Séra obsahující protilátky proti jedné z těchto značek — aglutinin — má dvě nebo více vazebných míst, takže když se setká s buňkami nesoucími svůj cílový antigen, propojí je dohromady do viditelných shluků. To je aglutinace: kapka ztrácí svůj hladký, rovnoměrný červený vzhled a stává se zrnitou, s tmavšími tečkami v čistící se tekutině. Pokud antigen chybí, protilátka se nemá na co navázat a kapka zůstává jednotná. Test se proto vyhodnocuje jako jednoduché ano nebo ne, a to třikrát za sebou.
V této laboratoři budete určovat krevní skupinu u osmi neznámých vzorků krve. Každý vzorek je umístěn ve třech samostatných jamkách a postupně vystaven působení séra anti-A, anti-B a anti-Rh. Každou jamku promíchejte skleněnou tyčinkou, kterou je nutné mezi jednotlivými jamkami opláchnout a osušit, aby nedošlo k přenosu séra z jednoho testu do druhého. Z kombinace tří odpovědí typu ano-ne odvodíte systém ABO a Rh faktor každého vzorku a následně zjistíte, který z nich může bezpečně darovat krev kterému.
Vzdělávací cíle
Seznámení s laboratorním prostředím
- Najděte jamkové destičky a schéma jejich označení, tři kapátka se sérem, skleněnou tyčinku, destilovanou vodu a absorpční papír a pochopte, proč každý vzorek potřebuje tři jamky namísto jedné.
Bezpečné zacházení s biologickými vzorky
- Každý vzorek krve považujte za potenciálně infekční: noste rukavice a ochranu očí, vyhněte se kontaktu s kůží a kontaminovaný materiál zlikvidujte jako nebezpečný biologický odpad namísto běžného odpadu.
Zamezení křížové kontaminaci
- Skleněnou tyčinku mezi jednotlivými mícháními opláchněte a osušte a vysvětlete, jak by vypadal falešně pozitivní výsledek, pokud by sérum bylo přeneseno z jamky s anti-A do jamky s anti-B.
- Přidejte sérum do krve, aniž byste se hrotem kapátka dotkli jamky, aby se zásobní sérum zpětně kontaminovalo.
Vyhodnocení aglutinační reakce
- Rozlišujte skutečně aglutinovanou kapku — zrnitou, shluknutou, s viditelnými agregáty na čistším pozadí — od nereagované kapky, která zůstává hladká a rovnoměrně zbarvená.
- Zaznamenejte každé z čtyřiadvaceti pozorování jako kladné nebo záporné, než se pokusíte o jakoukoli interpretaci.
Určení krevní skupiny ABO a Rh faktoru
- Převeďte vzorec tří výsledků na krevní skupinu a uveďte, které antigeny jsou přítomny na buňkách a které protilátky jsou proto přítomny v plazmě.
Úvaha o transfuzní kompatibilitě
- Pomocí výsledků testu pište, které páry darující–příjemce jsou bezpečné, a v termínech antigen–protilátka vysvětlete, proč je skupina 0 Rh− univerzálním dárcem červených krvinek a skupina AB Rh+ univerzálním příjemcem.
Protokol
- Aplikujte 5 kapek vzorku krve 1 do každé ze 3 jamek označených následujícím způsobem:
- dobře 1 (anti_A)
- dobře 1 (anti_B)
- dobře 1 (anti_Rh)
- Do dobře označené jamky 1 (1/anti-A) přidejte 2 kapky anti-A aglutininu.
- Okamžitě promíchejte čistou skleněnou tyčinkou.
- Do welličky označené 1 (1/anti-B) přidejte 2 kapky anti-B aglutininu.
- Okamžitě promíchejte čistou skleněnou tyčinkou.
- Do jamky označené 1 (1/anti-Rh) přidejte 2 kapky anti-Rh aglutininu.
- Okamžitě promíchejte čistou skleněnou tyčinkou.
- Opláchněte skleněnou tyčinku destilovanou vodou.
- Osušte skleněnou tyčinku savým papírem.
- Zopakujte kroky pro vzorky krve 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8.
Předvídané výsledky
| Vzorek krve | anti-A | anti-B | anti-Rh | Krevní skupina |
|---|---|---|---|---|
| 1 | aglutinace | — | aglutinace | A Rh+ (A+) |
| 2 | aglutinace | aglutinace | — | AB Rh− (AB−) |
| 3 | — | — | — | 0 Rh− (0−) |
| 4 | aglutinace | — | — | A Rh− (A−) |
| 5 | — | — | aglutinace | O Rh+ (O+) |
| 6 | aglutinace | aglutinace | aglutinace | AB Rh+ (AB+) |
| 7 | — | aglutinace | — | B Rh− (B−) |
| 8 | — | aglutinace | aglutinace | B Rh+ (B+) |
Jak se vzor čte
Každá jamka odpovídá na jednu otázku: je tento antigen na buňkách? Aglutinace s anti-A znamená, že je přítomen antigen A, aglutinace s anti-B znamená, že je přítomen antigen B, a krevní skupina ABO vyplývá přímo – samotné A dává skupinu A, samotné B dává skupinu B, obě dávají skupinu AB, ani jedno dává skupinu O. Třetí jamka se čte nezávisle na prvních dvou: aglutinace s anti-Rh znamená, že buňky nesou antigen D a vzorek je Rh pozitivní, žádná aglutinace znamená Rh negativní. Vzorek 3 je jediný, který dává tři negativní výsledky, a je to jediný vzorek O Rh−; vzorek 6 je jediný, který dává tři pozitivní výsledky, a je to jediný vzorek AB Rh+.
Proč se tvoří hrudky
Protilátky anti-A a anti-B jsou protilátky třídy IgM, což jsou velké pentamerní molekuly s deseti vazebnými místy pro antigen. Jediná molekula IgM tak může navázat několik červených krvinek naraz a několik tisíc z nich promění hladkou suspenzi během několika sekund v mřížku propojených buněk. To je důvod, proč se reakce systému ABO odečítá při pokojové teplotě pouhým okem a nevyžaduje žádnou inkubaci. Protilátka anti-D je typicky IgG, má pouze dvě vazebná místa, takže v klinické laboratoři test Rh často vyžaduje delší reakci nebo přidané činidlo; zde se však odečítá stejně jako ostatní.
Protilátky systému ABO jsou také neobvyklé tím, že jsou přítomny bez předchozí expozice lidské krvi. Osoba skupina A nese v plazmě anti-B již od kojeneckého věku, což je téměř jistě vyvoláno velmi podobnými cukernými strukturami na střevních bakteriích. Každý jedinec má proto protilátky proti přesně těm antigenům ABO, které jeho vlastní buňky postrádají – to je pravidlo, díky němuž je neshoda v systému ABO tak okamžitě nebezpečná.
Důsledky transfuze
| Skupina | Antigeny na červených krvinkách | Protilátky v plazmě | Může přijímat červené krvinky od |
|---|---|---|---|
| A | A | anti-B | A, O |
| B | B | anti-A | B, O |
| AB | A a B | žádné | A, B, AB, O |
| O | žádné | anti-A a anti-B | O |
Rh přidává druhé, asymetrické omezení. Příjemce s Rh−, který obdrží Rh+ buňky, nereaguje při první expozici, protože protilátky anti-D nejsou přirozeně přítomné, ale imunitní systém je senzitizován a pozdější transfuze Rh+ může vyvolat těžkou hemolýzu. Stejný mechanismus je základem hemolytické nemoci novorozenců: matka s Rh− nesoucí plod s Rh+ může produkovat anti-D, které v následujícím těhotenství prochází placentou, což je důvod, proč se podává profilaktický anti-D imunoglobulin. Z osmi vzorků zde jsou 2, 3, 4 a 7 Rh negativní a potřebovaly by Rh− krev.
Shrnutí úkolů podle věkové kategorie
9. až 10. ročník
- Fokus — pečlivé pozorování a slovní zásoba testu: antigen, protilátka, aglutinin, aglutinace, skupina ABO, faktor Rh, darce, příjemce.
- Aktivity — napište všech osm vzorků, zaznamenejte každou z dvaceti čtyř jamek jako pozitivní nebo negativní do výsledkové mřížky a poté určete skupinu každého vzorku podle jeho vzorce. Odpovězte na navádějící otázky: který vzorek nevykázal žádnou reakci a co vám to říká o jeho červených krvinkách? Proč se skleněná tyčinka musí mezi jednotlivými jamkami oplachovat?
11. ročník
- Fokus — přechod od pozorování k základní imunologii a využití výsledků k predikcím.
- Aktivity — u každého z osmi vzorků uveďte antigeny na buňkách a protilátky ABO v plazmě; sestavte úplnou mřížku kompatibility mezi dárcem a příjemcem pro osm vzorků a identifikujte každou bezpečnou dvojici; vysvětlete, proč vzorek 3 může darovat červené krvinky všem ostatním sedmi, zatímco vzorek 6 nemůže darovat žádnému z nich; a vysvětlete, proč musí být test na Rh faktor odečten odděleně od testů ABO, a nikoli s nimi kombinován.
12. ročník / Úroveň college
- Fokus — genetika a chemie protilátek.
- Aktivity — určete možné genotypy systému ABO pro každý pozorovaný fenotyp (iAiA nebo jáAi pro skupinu A a tak dále) a vysvětlete, proč je alela AB kodominantní, zatímco O je recesivní; objasněte rozdíl mezi IgM a IgG z hlediska valence a to, jak tento rozdíl mění způsob klinického stanovení anti-D výsledku; navrhněte kontrolu inverzního (nepřímého) určení krevní skupiny, která by potvrdila každý z osmi výsledků, a uveďte, co by znamenala neshoda mezi přímým a nepřímým určením krevní skupiny; a vysvětlete mechanismus a načasování podání anti-D profylaxe u Rh− matky, přičemž jako řešené příklady využijte vzorky 2, 3, 4 a 7.
Laboratorní potřeby
Nástroje
- Destičky s jamkami (tři jamky na vzorek krve, označené anti-A, anti-B a anti-Rh)
- Kapátka, jedno na sérum
- Skleněná tyčinka (míchací)
- Absorpční papír
- Rukavice a ochrana očí
Produkty
- 8 vzorků krve neznámé skupiny (po 5 kapkách od každého do jamky)
- Séroaglutinin Anti-A (2 kapky na test)
- Sérum anti-B aglutininu (2 kapky na test)
- Anti-Rh agglutinační sérum (2 kapky na test)
- Destilovaná voda (k oplachu skleněné tyčinky)